Hãy tưởng tượng nắm giữ một chìa khóa theo dõi chính xác sự thay đổi biểu hiện gen trong tế bào. PCR định lượng thời gian thực (qPCR) là công cụ đáng chú ý đó.Kỹ thuật phân tử tiên tiến này không chỉ phát hiện các chuỗi DNA cụ thể mà còn đo chính xác số lượng của chúng, cách mạng hóa nghiên cứu di truyền và chẩn đoán.
Không giống như PCR truyền thống phân tích kết quả sau khi khuếch đại, qPCR theo dõi việc sao chép DNA trong thời gian thực thông qua các tín hiệu huỳnh quang.Sự khác biệt này làm cho qPCR, còn được gọi là PCR thời gian thực định lượng, một công cụ mạnh mẽ cho phân tích động.
PCR phiên âm ngược (RT-PCR) phục vụ một mục đích khác, khuếch đại các mục tiêu RNA bằng cách chuyển đổi chúng thành cDNA.QPCR chuyên về định lượng thời gian thực.
Phương pháp SYBR Green phản ánh chu kỳ ba giai đoạn của PCR truyền thống nhưng kết hợp một chất nhuộm huỳnh quang liên kết tất cả các chuỗi DNA kép.thuốc nhuộm này phát ra ánh huỳnh quang có thể đo lường tỷ lệ thuận với nồng độ DNA.
Mặc dù hiệu quả về chi phí, sự thiếu đặc tính của SYBR Green đòi hỏi phân tích đường cong nóng chảy để phân biệt khuếch đại mục tiêu từ các sản phẩm không đặc biệt như chất kích thích.
Hệ thống TaqMan sử dụng các đầu dò oligonucleotide với các báo cáo huỳnh quang và thuốc dập.Các đầu dò này đặc biệt liên kết các chuỗi mục tiêu và giải phóng huỳnh quang khi được chia bởi hoạt động ngoại hạt 5'-3' của Taq polymerase trong quá trình mở rộng.
Mặc dù đắt hơn, TaqMan cung cấp những lợi thế quan trọng:
Các kết quả qPCR thường hiển thị dưới dạng đường cong khuếch đại vẽ phông quang so với chu kỳ nhiệt.Chu kỳ ngưỡng (Ct) khi phát quang vượt quá nền cho thấy nồng độ DNA ban đầu, với các giá trị Ct thấp hơn phản ánh lượng khởi đầu cao hơn.
Các nỗ lực tiêu chuẩn hóa thông qua các hướng dẫn MIQE (Thông tin tối thiểu cho các thí nghiệm PCR thời gian thực định lượng) đảm bảo khả năng tái tạo thí nghiệm bằng cách yêu cầu báo cáo giao thức toàn diện.
Trước khi giải thích dữ liệu, các xét nghiệm qPCR yêu cầu xác nhận:
Xác định số bản sao mục tiêu chính xác bằng cách so sánh các giá trị Ct mẫu với đường cong tiêu chuẩn của nồng độ được biết đến quan trọng đối với các ứng dụng như kiểm tra tải virus.
So sánh biểu hiện gen giữa các mẫu sử dụng các gen tham chiếu. Phương pháp ΔΔCt (đối với phản ứng hiệu suất 95-105%) hoặc phương pháp Pfaffl (đối với hiệu suất biến) tính toán các thay đổi gấp biểu hiện.
Các phương pháp này cho phép các nhà nghiên cứu đo lường chính xác các biến thể di truyền, thúc đẩy các lĩnh vực từ nghiên cứu ung thư đến giám sát bệnh truyền nhiễm.
Người liên hệ: Ms. Lisa
Vietnamese
