Nếu PCR thông thường phục vụ như một "gương phóng đại" của sinh học phân tử, thì PCR định lượng thời gian thực (qPCR) hoạt động như một "máy hiển vi" chính xác." Công nghệ tiên tiến này không chỉ khuếch đại các chuỗi gen mục tiêu mà còn theo dõi quá trình khuếch đại trong thời gian thực, cho phép định lượng chính xác mức độ biểu hiện gen.Sự chuyển đổi từ ước tính thô của PCR điểm cuối sang độ chính xác và hiệu quả của PCR thời gian thực đại diện cho một sự phát triển không thể tránh khỏi trong nghiên cứu sinh học phân tử hiện đại.
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR), một kỹ thuật mang tính cách mạng trong sinh học phân tử, sử dụng các chất khởi tạo oligonucleotide cụ thể theo trình tự, DNA polymerase kháng nhiệt,và chu kỳ nhiệt chính xác để nhân rộng theo cấp số nhân các chuỗi DNA hoặc cDNA cụ thể, đạt được một triệu lần khuếch đại. Traditional endpoint PCR requires post-reaction detection and quantification through gel electrophoresis and image analysis—a time-consuming process with limited precision that struggles to meet growing demands for quantitative analysis.
QPCR thời gian thực đã thay đổi cảnh quan này bằng cách theo dõi sản xuất sản phẩm trong mỗi chu kỳ PCR.Các nhà nghiên cứu có thể xác định số lượng chuỗi mục tiêu ban đầu với độ chính xác đặc biệtTrong khi PCR về mặt lý thuyết tăng gấp đôi các phân tử mục tiêu mỗi chu kỳ, những nỗ lực ban đầu để định lượng vật liệu bắt đầu thông qua đếm chu kỳ và đo kết thúc sản phẩm đã được chứng minh là không đáng tin cậy.QPCR thời gian thực xuất hiện để đáp ứng nhu cầu định lượng mạnh mẽ, trong khi PCR điểm cuối vẫn chủ yếu hữu ích cho việc khuếch đại các mảnh DNA cụ thể cho trình tự, nhân bản và các ứng dụng sinh học phân tử khác.
Công nghệ đo hàm lượng DNA sau mỗi chu kỳ bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang liên kết với các sản phẩm PCR (amplicon).cho phép định lượng số tiền mẫu ban đầu thông qua việc theo dõi các thay đổi tín hiệuCác chất báo quang phổ biến bao gồm:
Các dụng cụ chuyên biệt kết hợp chu trình nhiệt với quét huỳnh quang để tạo ra đường cong khuếch đại (Hình 1) vẽ cường độ huỳnh quang so với số chu kỳ,đại diện cho sự tích lũy sản phẩm trong suốt quá trình PCR.
Công nghệ này đã trở thành tiêu chuẩn vàng cho việc phát hiện và định lượng DNA / RNA, đạt được độ chính xác gấp đôi với phạm vi động kéo dài từ 6 đến 8 thứ hạng.
Một giao thức PCR thời gian thực tiêu chuẩn chạy 40 chu kỳ, mỗi chu kỳ bao gồm:
Sự ủ ở nhiệt độ cao (thường là 95 ° C) làm tan chảy DNA chuỗi kép thành chuỗi đơn trong khi phá vỡ cấu trúc thứ cấp.
Các trình tự bổ sung lai ở nhiệt độ 5 °C dưới nhiệt độ nóng chảy của chất khởi tạo (Tm).
DNA polymerase hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 70-72 ° C, mở rộng các primers ở tốc độ lên đến 100 base / giây.
Cách tiếp cận này lần đầu tiên chuyển đổi RNA sang cDNA bằng cách sử dụng transcriptase ngược (RT) với ngẫu nhiên, oligo ((dT), hoặc các chất khởi tạo đặc trưng cho gen.Khoảng 10% cDNA sau đó được chuyển sang các ống riêng biệt cho PCR thời gian thựcƯu điểm bao gồm:
Kết hợp tổng hợp cDNA và PCR trong một ống duy nhất làm giảm nguy cơ nhiễm trùng và sai sót xử lý.làm cho nó lý tưởng cho các ứng dụng công suất cao.
PCR thời gian thực phục vụ các chức năng quan trọng trong:
Các công nghệ mới nổi như PCR kỹ thuật số và phân tích melt có độ phân giải cao hứa hẹn sẽ mở rộng các ứng dụng PCR thời gian thực.và khả năng phân tích dữ liệuCác ứng dụng trong tương lai có thể bao gồm y học cá nhân hóa, giám sát môi trường,và thử nghiệm an toàn thực phẩm định vị PCR thời gian thực như một công cụ không thể thiếu cho tiến bộ khoa học và sức khỏe cộng đồng.
Người liên hệ: Ms. Lisa
Vietnamese
