PCR so với Qpcr: Khác biệt chính về nguyên tắc và ứng dụng

Công nghệ khuếch đại gen, thường được mô tả là "máy sao chép" của lĩnh vực sinh học, đóng một vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh tật, nghiên cứu di truyền và các lĩnh vực khoa học khác.Trong số những công nghệ này, PCR và qPCR có vẻ giống nhau từ cái nhìn đầu tiên nhưng phục vụ các mục đích khác nhau.và đặc biệt là phương pháp phân tích dữ liệu của họ để giúp các nhà nghiên cứu đưa ra quyết định sáng suốt.

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật in vitro để khuếch đại các mảnh DNA cụ thể.PCR sử dụng các chu kỳ sưởi ấm và làm mát lặp đi lặp lại để tăng theo cấp số nhân các trình tự DNA mục tiêu. Cốt lõi của công nghệ nằm trong thiết kế bấm ✓ chuỗi ngắn bổ sung cho các đầu của DNA mục tiêu hướng dẫn DNA polymerase sao chép các vùng cụ thể.

1. Thiết kế:Làm nóng mẫu DNA (94-98 ° C) tách DNA hai sợi thành các sợi đơn.
2. Sản phẩm:Giảm nhiệt độ (50-65 °C) cho phép các chất khởi tạo liên kết với các chuỗi mục tiêu.
3. Mở rộng:Ở nhiệt độ tối ưu của polymerase (72 ° C), các chuỗi DNA mới được tổng hợp từ các chất khởi tạo.

Lặp lại các chu kỳ này nhanh chóng tạo ra hàng triệu bản sao DNA. Các sản phẩm PCR thường được phân tích thông qua điện giải gel agarose, tách các mảnh theo kích thước.

• Việc nhân bản gen:Khuếch đại các gen cụ thể để xây dựng DNA tái tổ hợp
• Xếp thứ tự DNA:Cung cấp đủ mẫu DNA
• Chẩn đoán bệnh:Phát hiện mầm bệnh hoặc đột biến di truyền
• Khoa học pháp lý:Chụp dấu vân tay DNA

PCR định lượng (qPCR), hoặc PCR thời gian thực, đại diện cho một phiên bản tiên tiến theo dõi khuếch đại DNA trong thời gian thực, cho phép định lượng chính xác.Công nghệ này sử dụng các dấu hiệu huỳnh quang tương quan với nồng độ DNA.

• Màu sắc huỳnh quang:SYBR Green liên kết DNA chuỗi kép, với độ huỳnh quang tăng lên trong quá trình khuếch đại. Chi phí hiệu quả nhưng ít cụ thể hơn.
• Các đầu dò huỳnh quangCác đầu dò theo trình tự đặc biệt phát ra tia huỳnh quang chỉ khi liên kết với mục tiêu.

Số lượng dựa trên giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) số chu kỳ khi phát quang vượt quá nền. Giá trị Ct thấp hơn cho thấy nồng độ DNA ban đầu cao hơn.

• Số lượng tương đối:So sánh biểu hiện gen mục tiêu giữa các mẫu bằng cách sử dụng gen tham chiếu để bình thường hóa
• Số lượng tuyệt đối:Xác định số bản sao DNA chính xác bằng cách sử dụng đường cong tiêu chuẩn từ nồng độ được biết

• Phân tích biểu hiện gen:đo nồng độ mRNA
• Khám phá mầm bệnh:Xác định số lượng viral/bacterial
• Phát triển thuốc:Đánh giá tác dụng dược lý đối với biểu hiện gen
• Nghiên cứu ung thư:Phát hiện các dấu hiệu sinh học khối u

PCR phiên âm ngược (RT-PCR) chuyển đổi RNA thành DNA bổ sung (cDNA) để khuếch đại tiếp theo, cho phép phát hiện RNA. Có hai định dạng:

• RT-PCR một bước:Kết hợp phiên bản ngược và PCR trong một ống duy nhất
• RT-PCR hai bước:Thực hiện các phản ứng theo trình tự

Kết hợp RT-PCR với qPCR tạo ra RT-qPCR, tiêu chuẩn vàng cho định lượng mRNA trong các nghiên cứu biểu hiện gen.

Phân tích PCR liên quan đến việc hình dung gel đơn giản của các dải DNA, chỉ ra sự hiện diện / vắng mặt và sự phong phú tương đối thông qua cường độ dải. Tuy nhiên, phương pháp này cung cấp độ chính xác định lượng hạn chế.

Phân tích qPCR cung cấp định lượng phức tạp thông qua các giá trị Ct, đòi hỏi:

• Sự điều chỉnh đường chuẩn để tính đến ánh sáng huỳnh nền
• Đặt ngưỡng chính xác để xác định chính xác Ct
• Phân tích đường cong nóng chảy để xác minh tính đặc trưng khuếch đại

Đối với định lượng tương đối, lựa chọn gen tham chiếu và bình thường hóa đúng là rất quan trọng, trong khi định lượng tuyệt đối đòi hỏi đường cong tiêu chuẩn chất lượng cao.

Lựa chọn giữa PCR và qPCR phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu:

• biểu hiện gen:RT-qPCR
• Khám phá mầm bệnh:qPCR
• Việc nhân bản gen:PCR
• Xếp thứ tự DNA:PCR

PCR đủ để phát hiện sự hiện diện/không có, trong khi qPCR là rất cần thiết cho các yêu cầu định lượng chính xác.