Việc chiết xuất axit nucleic là nền tảng của các thí nghiệm sinh học phân tử.nhiều nhà nghiên cứu thấy mình bối rối, đặc biệt là khi khắc phục sự cố kết quả không mong đợi. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable, quá trình hiệu quả.
Hầu hết các bộ dụng cụ chiết xuất axit nucleic thương mại sử dụng công nghệ cột quay màng silica, với năm giai đoạn quan trọng: phân giải tế bào, liên kết axit nucleic, rửa và làm sạch, sấy,và giải tán cuối cùngMỗi bước xây dựng trên một trước đó, có nghĩa là bất kỳ bước sai có thể gây nguy hiểm cho toàn bộ khai thác.
Lysis tế bào hiệu quả đại diện cho bước đầu tiên quan trọng.nhưng thường chứa nồng độ cao muối chaotropic phục vụ hai mục đích:
Các muối chaootropic phổ biến bao gồm guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, urea và lithium perchlorate.Tùy thuộc vào loại mẫu, các enzyme cũng có thể được kết hợp. Proteinase K tiêu hóa hiệu quả protein trong các chế phẩm axit nucleic, đặc biệt là trong điều kiện biến dạng. Lysozyme là một enzyme phổ biến khác,mặc dù hoạt động của nó giảm trong điều kiện biến chất.
Việc chiết xuất plasmid khác biệt đáng kể với RNA hoặc phân lập DNA gen. Sự khác biệt quan trọng nằm ở việc tách DNA plasmid từ DNA gen.Thêm muối chaotropic ngay lập tức sẽ giải phóng tất cả các loại DNA không phân biệtDo đó, các giao thức plasmid thường giới thiệu các chaotrop sau quá trình phân giải tế bào ban đầu.
Ngoài quá trình phân giải, muối chaotrop giúp liên kết axit nucleic với các cột silica.Các cột silic có chứa nhựa liên kết DNA hoặc RNA một cách chọn lọc tùy thuộc vào nồng độ muối và các yếu tố khácCác axit nucleic kết quả cho thấy độ tinh khiết cao phù hợp cho nhân bản, trình tự đọc dài và các ứng dụng khác.
Nồng độ ethanol là rất quan trọng, quá nhiều ethanol gây ra chất phân hủy và các phân tử nhỏ, ảnh hưởng đến độ hấp thụ A260.Không đủ ethanol có thể cản trở việc loại bỏ muối từ màng. Các khối lượng ethanol được cung cấp trong bộ được tối ưu hóa trước, nhưng nếu DNA phân hủy dường như làm sai lệch các phép đọc A260, việc tối ưu hóa lại nồng độ ethanol có thể giúp.Các dung dịch chảy qua có thể được lưu lại cho sự kết tủa để phục hồi các axit nucleic bị mấtKhi các chất tẩy rửa có chứa SDS được sử dụng trong quá trình phân giải, NaCl đóng vai trò là chất kết tủa hiệu quả tránh ô nhiễm chất tẩy rửa.
Sau khi lyzat được ly tâm qua màng silica, các axit nucleic mục tiêu liên kết với các cột trong khi protein và polysaccharide vẫn lưu thông.màng giữ lại các protein và muối còn lạiCác mẫu thực vật có thể để lại polysaccharides và sắc tố; các mẫu máu thường tạo ra màu nâu hoặc vàng.
Hai lần rửa là điển hình, mặc dù số lượng chính xác phụ thuộc vào loại mẫu.tiếp theo là rửa ethanol để loại bỏ muốiCác mẫu ban đầu có hàm lượng protein thấp (ví dụ, chuẩn bị plasmid hoặc tinh khiết sản phẩm PCR) chỉ có thể cần rửa ethanol.Một số bộ dụng cụ khuyên nên rửa bằng ethanol hai lần. Các muối còn lại ức chế sự nhũ hóa, làm giảm năng suất và tăng lượng A230 làm giảm tỷ lệ A260/230.
Hầu hết các giao thức bao gồm ly tâm sau khi rửa để làm khô ethanol dư thừa từ cột.Thêm 10 mM Tris đệm hoặc nước sau đó tái hydrat hóa axit nucleic để giải phóng màngEthanol còn lại ngăn ngừa hoàn toàn tái hydrat hóa và trục xuất trong khi ethanol không thể phát hiện bằng quang phổCác dấu hiệu tiết lộ bao gồm các mẫu không lắng đọng trong các giếng agarose gel (ngay cả khi có chất nhuộm tải) hoặc không thể đông lạnh ở -20 °C.
Bước chiết xuất DNA cuối cùng giải phóng các axit nucleic tinh khiết từ silica.DNA vẫn ổn định hơn ở độ pH kiềm yếu và hòa tan nhanh hơn trong đệm so với nước. Ngay cả các chất lắng đọng DNA cũng có hành vi tương tự. Nước thường có độ pH thấp hơn (4-5), và trọng lượng phân tử cao của DNA có thể không hoàn toàn tái hydrat hóa nhanh chóng. Để phục hồi DNA tối đa,để đệm ngồi trên màng trong vài phút trước khi ly tâmĐối với các ứng dụng đòi hỏi DNA khối lượng phân tử cao nguyên vẹn (ví dụ, trình tự đọc dài), bộ đệm elution là tối ưu. RNA dung nạp pH axit yếu và dễ dàng hòa tan trong nước,làm cho nước là chất pha loãng ưa thích.
Ngay cả khi tuân thủ các giao thức tiêu chuẩn, việc chiết xuất có thể gặp nhiều vấn đề:
Phân giải không hoàn chỉnh có thể biểu hiện như năng suất thấp bất ngờ, giải thể protein không hoàn chỉnh hoặc tỷ lệ A260/230 kém.Những điều này cho thấy một số thành phần mẫu đã không hoàn toàn lyse hoặc hòa tan trong quá trình chiết xuấtPhân biệt phân giải không hoàn chỉnh từ ô nhiễm hoặc phân hủy đòi hỏi phải phân tích cẩn thận các điều kiện chiết xuất, bao gồm thành phần đệm phân giải, tham số ủ,và các chất gây nhiễu tiềm năngVí dụ, tỷ lệ A260/230 kém có thể chỉ ra muối còn lại sau khi liên kết hoặc rửa không đủ thay vì phân giải không hoàn chỉnh.Giải quyết phân giải không hoàn chỉnh có thể yêu cầu tối ưu hóa các thành phần đệm phân giải, thời gian ủ, hoặc kết hợp các phương pháp phân giải cơ học / enzyme bổ sung.
Các kỹ thuật chuyên biệt nhắm đến việc loại bỏ các chất humic và các chất can thiệp khác có thể đồng thanh lọc với axit nucleic từ các mẫu môi trường.Chúng bao gồm các bộ đệm chiết xuất chuyên dụng có chứa các chất chelating (e.g., EDTA) để liên kết và loại bỏ các cation một cách chọn lọc.Các phương pháp xử lý trước như ly tâm khác biệt hoặc lọc có thể giúp loại bỏ các hạt lớn hơn từ các mẫu môi trường trước khi chiết xuất axit nucleic, giảm nhiễu trong các bước ràng buộc.
Một số mẫu (ví dụ: mô hoặc vật liệu giàu lipid) tạo ra những thách thức đặc biệt.Các mẫu mô thường đòi hỏi sự gián đoạn cơ học bổ sung hoặc tiêu hóa bằng enzym để đảm bảo phân giải hoàn chỉnh và giải phóng axit nucleicCác mẫu giàu lipid có thể làm phức tạp quá trình lọc vì lipid có thể can thiệp vào việc liên kết axit nucleic với ma trận cột.tối ưu hóa các giao thức thanh lọc, hoặc sử dụng các bộ thiết kế đặc biệt.
Được xuất bản ban đầu vào ngày 28 tháng 6 năm 2010.
Người liên hệ: Ms. Lisa
Vietnamese
