Khi đại dịch COVID-19 tiếp tục đặt ra những thách thức toàn cầu, xét nghiệm RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược) vẫn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhiễm SARS-CoV-2. Nhưng có bao nhiêu người thực sự hiểu được các nguyên tắc khoa học đằng sau công cụ chẩn đoán quan trọng này? Bài viết này cung cấp giải thích sâu sắc nhưng dễ tiếp cận về xét nghiệm RT-PCR, giúp cả chuyên gia y tế và công chúng hiểu rõ hơn về công nghệ quan trọng này.
RT-PCR, hay Phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược thời gian thực, là một kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao và nhanh chóng được sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền cụ thể trong các mẫu. Vật liệu di truyền này có thể có nguồn gốc từ con người, vi khuẩn hoặc vi rút như SARS-CoV-2.
Công nghệ cốt lõi đằng sau RT-PCR là PCR, do Kary B. Mullis phát minh vào những năm 1980 (mang về cho ông giải thưởng Nobel). PCR khuếch đại và phát hiện các mục tiêu DNA cụ thể. Những cải tiến sau này cho phép hiển thị và định lượng "thời gian thực" các mục tiêu DNA trong quá trình khuếch đại. Trong PCR thời gian thực, cường độ huỳnh quang từ các đầu dò chuyên dụng tương quan với lượng DNA được khuếch đại.
Tuy nhiên, PCR tiêu chuẩn chỉ phát hiện được DNA. Vì SARS-CoV-2 chứa vật liệu di truyền RNA nên xét nghiệm yêu cầu enzyme phiên mã ngược để chuyển RNA thành DNA bổ sung (cDNA). Bước sao chép ngược này, kết hợp với PCR thời gian thực, khiến RT-PCR trở thành một công cụ mạnh mẽ để phát hiện các virus RNA như SARS-CoV-2.
Để hiểu RT-PCR đòi hỏi kiến thức cơ bản về vật liệu di truyền—sách hướng dẫn chi phối hành vi, sự sống sót và sinh sản của tế bào và virus. Vật liệu di truyền có hai dạng chính: DNA (axit deoxyribonucleic) và RNA (axit ribonucleic). DNA có cấu trúc chuỗi kép trong khi RNA có cấu trúc chuỗi đơn. Đối với mục đích chẩn đoán, tính ổn định cao hơn của DNA khiến nó được ưa chuộng hơn trong xét nghiệm bệnh truyền nhiễm. Đáng chú ý, SARS-CoV-2 chỉ chứa RNA.
Tất cả các virus đều có chung đặc điểm là phụ thuộc vào tế bào chủ để tồn tại và nhân lên. SARS-CoV-2, giống như các loại virus khác, xâm nhập vào các tế bào khỏe mạnh để sinh sản. Khi nhiễm trùng xảy ra, virus sẽ giải phóng RNA của nó và chiếm quyền điều khiển bộ máy tế bào để nhân lên. Miễn là vật liệu di truyền của virus vẫn còn trong tế bào, RT-PCR có thể phát hiện tình trạng nhiễm SARS-CoV-2.
Các nhân viên y tế đã được đào tạo sẽ thu thập các mẫu bệnh phẩm từ dịch mũi họng, sau đó đặt vào các ống vô trùng chứa môi trường vận chuyển virus để bảo tồn tính toàn vẹn của virus.
Trong phòng thí nghiệm, các nhà nghiên cứu chiết xuất RNA bằng bộ dụng cụ tinh chế thương mại. Sau đó, mẫu RNA được thêm vào hỗn hợp phản ứng chứa tất cả các thành phần cần thiết để xét nghiệm, bao gồm DNA polymerase, enzyme sao chép ngược, khối xây dựng DNA cũng như đầu dò và mồi huỳnh quang đặc hiệu SARS-CoV-2.
Vì PCR chỉ hoạt động với các mẫu DNA nên enzyme phiên mã ngược sẽ chuyển đổi tất cả RNA trong mẫu (bao gồm cả RNA của người, vi khuẩn, RNA của virus corona khác và có thể cả RNA của SARS-CoV-2) thành cDNA.
Quá trình này bao gồm ba bước lặp lại:
Quá trình này thường lặp lại 40 lần, nhân đôi DNA mục tiêu sau mỗi chu kỳ. Đầu dò huỳnh quang liên kết với dòng mồi, giải phóng các tín hiệu có thể phát hiện được sau mỗi lần khuếch đại DNA. Tăng DNA mục tiêu tương quan với cường độ huỳnh quang tăng.
Dữ liệu huỳnh quang tạo ra giá trị "Ngưỡng chu kỳ" (Ct)—số chu kỳ cần thiết để tín hiệu vượt quá mức nền. Các mẫu có nhiều DNA mục tiêu sẽ khuếch đại nhanh hơn, yêu cầu ít chu kỳ hơn (giá trị Ct thấp hơn). Ngược lại, DNA mục tiêu khan hiếm đòi hỏi nhiều chu kỳ hơn (giá trị Ct cao hơn).
Giá trị Ct cung cấp thông tin quan trọng về tải lượng virus. Giá trị Ct thấp hơn cho thấy số lượng bộ gen virus cao hơn, trong khi giá trị cao hơn cho thấy số lượng thấp hơn. Các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe kết hợp giá trị Ct với các triệu chứng và bệnh sử lâm sàng để đánh giá giai đoạn bệnh. Các giá trị Ct nối tiếp từ xét nghiệm lặp lại giúp theo dõi tiến triển của bệnh và dự đoán khả năng phục hồi. Công cụ theo dõi tiếp xúc cũng sử dụng giá trị Ct để ưu tiên những bệnh nhân có tải lượng virus cao nhất (và do đó có nguy cơ lây truyền cao nhất).
Mặc dù là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán COVID-19, RT-PCR có những hạn chế:
Xét nghiệm RT-PCR vẫn cần thiết để chẩn đoán COVID-19 bằng cách phát hiện vật liệu di truyền của SARS-CoV-2. Giá trị Ct đóng vai trò là chỉ số quan trọng về tải lượng virus, tiến triển bệnh và nguy cơ lây truyền. Tuy nhiên, những hạn chế của xét nghiệm đòi hỏi phải kết hợp kết quả với đánh giá lâm sàng để chẩn đoán và quản lý chính xác.
Khi đại dịch COVID-19 tiếp tục đặt ra những thách thức toàn cầu, xét nghiệm RT-PCR (Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược) vẫn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán nhiễm SARS-CoV-2. Nhưng có bao nhiêu người thực sự hiểu được các nguyên tắc khoa học đằng sau công cụ chẩn đoán quan trọng này? Bài viết này cung cấp giải thích sâu sắc nhưng dễ tiếp cận về xét nghiệm RT-PCR, giúp cả chuyên gia y tế và công chúng hiểu rõ hơn về công nghệ quan trọng này.
RT-PCR, hay Phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược thời gian thực, là một kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao và nhanh chóng được sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền cụ thể trong các mẫu. Vật liệu di truyền này có thể có nguồn gốc từ con người, vi khuẩn hoặc vi rút như SARS-CoV-2.
Công nghệ cốt lõi đằng sau RT-PCR là PCR, do Kary B. Mullis phát minh vào những năm 1980 (mang về cho ông giải thưởng Nobel). PCR khuếch đại và phát hiện các mục tiêu DNA cụ thể. Những cải tiến sau này cho phép hiển thị và định lượng "thời gian thực" các mục tiêu DNA trong quá trình khuếch đại. Trong PCR thời gian thực, cường độ huỳnh quang từ các đầu dò chuyên dụng tương quan với lượng DNA được khuếch đại.
Tuy nhiên, PCR tiêu chuẩn chỉ phát hiện được DNA. Vì SARS-CoV-2 chứa vật liệu di truyền RNA nên xét nghiệm yêu cầu enzyme phiên mã ngược để chuyển RNA thành DNA bổ sung (cDNA). Bước sao chép ngược này, kết hợp với PCR thời gian thực, khiến RT-PCR trở thành một công cụ mạnh mẽ để phát hiện các virus RNA như SARS-CoV-2.
Để hiểu RT-PCR đòi hỏi kiến thức cơ bản về vật liệu di truyền—sách hướng dẫn chi phối hành vi, sự sống sót và sinh sản của tế bào và virus. Vật liệu di truyền có hai dạng chính: DNA (axit deoxyribonucleic) và RNA (axit ribonucleic). DNA có cấu trúc chuỗi kép trong khi RNA có cấu trúc chuỗi đơn. Đối với mục đích chẩn đoán, tính ổn định cao hơn của DNA khiến nó được ưa chuộng hơn trong xét nghiệm bệnh truyền nhiễm. Đáng chú ý, SARS-CoV-2 chỉ chứa RNA.
Tất cả các virus đều có chung đặc điểm là phụ thuộc vào tế bào chủ để tồn tại và nhân lên. SARS-CoV-2, giống như các loại virus khác, xâm nhập vào các tế bào khỏe mạnh để sinh sản. Khi nhiễm trùng xảy ra, virus sẽ giải phóng RNA của nó và chiếm quyền điều khiển bộ máy tế bào để nhân lên. Miễn là vật liệu di truyền của virus vẫn còn trong tế bào, RT-PCR có thể phát hiện tình trạng nhiễm SARS-CoV-2.
Các nhân viên y tế đã được đào tạo sẽ thu thập các mẫu bệnh phẩm từ dịch mũi họng, sau đó đặt vào các ống vô trùng chứa môi trường vận chuyển virus để bảo tồn tính toàn vẹn của virus.
Trong phòng thí nghiệm, các nhà nghiên cứu chiết xuất RNA bằng bộ dụng cụ tinh chế thương mại. Sau đó, mẫu RNA được thêm vào hỗn hợp phản ứng chứa tất cả các thành phần cần thiết để xét nghiệm, bao gồm DNA polymerase, enzyme sao chép ngược, khối xây dựng DNA cũng như đầu dò và mồi huỳnh quang đặc hiệu SARS-CoV-2.
Vì PCR chỉ hoạt động với các mẫu DNA nên enzyme phiên mã ngược sẽ chuyển đổi tất cả RNA trong mẫu (bao gồm cả RNA của người, vi khuẩn, RNA của virus corona khác và có thể cả RNA của SARS-CoV-2) thành cDNA.
Quá trình này bao gồm ba bước lặp lại:
Quá trình này thường lặp lại 40 lần, nhân đôi DNA mục tiêu sau mỗi chu kỳ. Đầu dò huỳnh quang liên kết với dòng mồi, giải phóng các tín hiệu có thể phát hiện được sau mỗi lần khuếch đại DNA. Tăng DNA mục tiêu tương quan với cường độ huỳnh quang tăng.
Dữ liệu huỳnh quang tạo ra giá trị "Ngưỡng chu kỳ" (Ct)—số chu kỳ cần thiết để tín hiệu vượt quá mức nền. Các mẫu có nhiều DNA mục tiêu sẽ khuếch đại nhanh hơn, yêu cầu ít chu kỳ hơn (giá trị Ct thấp hơn). Ngược lại, DNA mục tiêu khan hiếm đòi hỏi nhiều chu kỳ hơn (giá trị Ct cao hơn).
Giá trị Ct cung cấp thông tin quan trọng về tải lượng virus. Giá trị Ct thấp hơn cho thấy số lượng bộ gen virus cao hơn, trong khi giá trị cao hơn cho thấy số lượng thấp hơn. Các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe kết hợp giá trị Ct với các triệu chứng và bệnh sử lâm sàng để đánh giá giai đoạn bệnh. Các giá trị Ct nối tiếp từ xét nghiệm lặp lại giúp theo dõi tiến triển của bệnh và dự đoán khả năng phục hồi. Công cụ theo dõi tiếp xúc cũng sử dụng giá trị Ct để ưu tiên những bệnh nhân có tải lượng virus cao nhất (và do đó có nguy cơ lây truyền cao nhất).
Mặc dù là tiêu chuẩn vàng chẩn đoán COVID-19, RT-PCR có những hạn chế:
Xét nghiệm RT-PCR vẫn cần thiết để chẩn đoán COVID-19 bằng cách phát hiện vật liệu di truyền của SARS-CoV-2. Giá trị Ct đóng vai trò là chỉ số quan trọng về tải lượng virus, tiến triển bệnh và nguy cơ lây truyền. Tuy nhiên, những hạn chế của xét nghiệm đòi hỏi phải kết hợp kết quả với đánh giá lâm sàng để chẩn đoán và quản lý chính xác.
